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T/CQAAS 006-2023 花椒品种分子身份证构建方法

T/CQAAS 006-2023 花椒品种分子身份证构建方法

T/CQAAS 006-2023

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内容简介

3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 标准样品经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品,本标准中为农作物种子,即农作物的种植材料或者繁殖材料,包括籽粒、果实和根、茎、苗、芽、叶等。3.2 分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。3.3 SSR标记是一类由几个核苷酸(一般为1~6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列,由于基本单元重复次数的不同,形成了SSR长度的多态性。3.4 DNA指纹具有完全个体特异的DNA多态性,本标准中指SSR等分子标记扩增的多态性。3.5 品种身份证指反映品种的商品属性和DNA指纹信息的数字和(或)字母组合。4 方法4.1 DNA提取采用改良的CTAB法提取花椒新鲜叶片的DNA,具体包括以下步骤:(1)在65℃水浴中预热提前配置好的2×CTAB提取缓冲液,0.1MTris-HCl、0.02MEDTA、1.4MNaCl、2%PVP、2%CTAB;(2)在液氮中研磨石榴叶片至粉末状,转至2.0mL离心管中;(3)迅速加入2×CTAB提取缓冲液1.0mL,10μlβ-巯基乙醇,混匀,65℃水浴60min,隔10-15min颠倒摇匀一次;(4)常温下12000rpm离心5min,吸上清转移至新的2.0mL离心管中;(5)加入等体积的氯仿/异戊醇,充分混匀5min,放置5min,12000rpm常温离心10min;(6)吸上清到新的2.0mL离心管中,用氯仿/异戊醇重复抽提一次;(7)离心,吸上清到新的离心管中,加入等体积的异丙醇混匀,-20℃放置2h,沉淀DNA;(8)10000rpm常温离心10min;(9)倒掉异丙醇,用500μL乙醇洗沉淀两次,吹干后用100μLTE溶解DNA;(10)加入10mg/mlRNaseA2μL终浓度200ng/ul混匀,37℃保温2h以上;(11)加入500μLTE,再加入等体积的氯仿/异戊醇,轻轻颠倒摇匀2min;(12)12000rpm常温离心10min;(13)吸上清到新的离心管中,加入等体积的异丙醇混匀,-20℃放置2h,沉淀DNA;(14)12000rpm常温离心10min;(15)倒掉异丙醇,用500μL乙醇清洗沉淀两次,吹干后用50μLTE溶解DNA;4℃冰箱中保存。(16)使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。4.2 花椒叶片的转录组分析从花椒种质资源中选择20个花椒品种或品系,提取叶片总RNA,送至上海美吉生物医药科技有限公司进行无参转录组测定,并在该公司在线分析平台美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com/)分析转录组数据。4.3 分子标记引物的设计根据20个花椒叶片转录组数据分析结果,设计SSR引物和Indel引物。由于SRAP引物为通用引物,因此根据以往的文献报道,设计SRAP上下游引物。4.4 SRAP标记扩增SRAP标记扩增体系是:样品基因组DNA1.0μL,2XTaq酶10.0μL,正反引物各1.0μL,ddH2O7.0μL;SRAP引物PCR扩增的程序:94℃预变性4min;94℃变性45s,35℃复性1min,72℃延伸2min,循环5次;再94℃变性45s,50℃退火1min,72℃延伸2min,循环35次;最后72℃延伸7min。4.5 电泳检测96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl,PCR产物1.0μl,其中该分子量内标和甲酰胺混合液两者的体积比为0.5:8.5;将PCR产物稀释40倍,在96孔板的各孔中分别加入8.5μl去离子甲酰胺、0.5μlLIZ-500分子量内标和1μl稀释后的PCR产物,95℃变性3min,于4℃放置10min,4000转min-1离心1min,于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳;预电泳15kV,3min;2kV电进样10s;电泳15kV,20min。4.6 数据分析用DataCollection软件收集原始数据,用Genemapper软件分析收集的原始数据,比较各峰值的位置与其泳道中的LIZ-500分子量内标,获得SSR扩增片段的精确分子量bp;将花椒品种的DNA指纹信息编码,再结合品种的形态学特征特性及可能具有的特异基因信息,构建花椒资源品种的分子身份证,并利用在线条码生成器http://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx?LANG=zhcn和二维码生成软件Encoder2以条码表述构建的花椒品种身份证。

起草单位

重庆市农业科学院果树研究所、重庆市江津区农产品质量安全中心、重庆市江津区花椒产业协会、重庆市江津区花椒加工业协会、重庆市江津先锋花椒城有限公司、重庆蓓廷农业科技有限公司

起草人

张义刚、程玥啨、谢永红、曾维友、范烨、苏家奎、池浩、周於强、童建川、陈秀强、赵海忠、杨仕春、刘瑜涵、李剑

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